Ricerche & Progetti

LINEE DI RICERCA DELLA PROF.SSA BALSANO 

STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI INDOTTI DAL VIRUS C DELL’EPATITE ALLA BASE DEL SUO POTENZIALE ONCOGENICO E PRO-FIBROTICO.

Il virus C dell’epatite (HCV) è uno dei principali agenti eziologici responsabili della progressione della Fibrosi epatica che può portare all’insorgenza del carcinoma epatocellulare. Un ruolo fondamentale nell’insorgenza della Fibrosi è rivestito dalle cellule stellate (HSCs) e dalla matrice extracellulare (ECM). Dal punto di vista molecolare il ruolo giocato dall’infezione in questo processo patologico è ancora in via di definizione; tuttavia, appare sempre più evidente che l’HCV attraverso la regolazione di numerosi processi biologici quali la proliferazione cellulare, l’infiammazione, il rimodellamento del citoscheletro e dell’ECM possa giocare un ruolo di primo piano. Utilizzando modelli sperimentali in vitro di infezione da HCV abbiamo studiato il suo ruolo pro-fibrogenico e pro-invasivo su linee cellulari epatiche e stellate. Le cellule di epatocarcinoma infettate da HCV mostrano un fenotipo più aggressivo caratterizzato da una riduzione della loro adesione al substrato ed un aumento della loro capacità migrante, di conseguenza aumenta la loro invasività. Le cellule stellate, invece, trattate con il mezzo condizionato delle cellule di epatocarcinoma infettate con HCV, mostrano un aumento della proliferazione cellulare e del fenotipo fibrogenico, evidenziato da un rimodellamento del citoscheletro e dall’aumentato rilascio del acido ialuronico (HA). I nostri studi mettono in luce che una elemento chiave nel meccanismo molecolare indotto dall’HCV è l’attivazione della proteinchinasi FAK (focaladhesionkinase) negli epatociti infettati. Infatti attraverso la sua up-regolazione ed iperattivazione il virus promuove la produzione ed il rilascio di una citochina fondamentale nel processo fibrogenetico, il TNFα (TumorNecrosisFactor α). Questa molecola infatti è in grado di attivare le cellule stellate. Attraverso i nostri studi, quindi, abbiamo dimostrano che il virus C attraverso la proteina FAK è in grado di aumentare l’aggressività delle cellule di epatocarcinoma ed al tempo stesso di promuovere l’induzione del fenotipo fibrotico nelle cellule stellate.

Pubblicazioni inerenti:

  1. Conti B, Minutolo A, Arciello M, Balsano C. Are Hedgehog and Wnt/β-catenin pathways involved in hepatitis C virus-mediated EMT? J Hepatol. 2013 Mar;58(3):636-7.
  2. Alisi A, Arciello M, Petrini S, Conti B, Missale G, Balsano C. Focal adhesion kinase (FAK) mediates the induction of pro-oncogenic and fibrogenic phenotypes in hepatitis C virus (HCV)-infected cells. PLoS One. 2012; 7(8): 44147.
  3. Alisi A, Tomaselli S, Balsano C, Gallo A. Hepatitis C virus therapeutics: editing enzymes promising therapeutic targets? Hepatology. 2011 Aug;54(2):742
  4. Balsano C, Conti B, Arciello M. Regarding: epithelial-mesenchymal transition induced by hepatitis C virus core protein in cholangiocarcinoma. Ann SurgOncol. 2011 Mar;18(3):896.

 

STUDIO DELLA STEATOSI EPATICA IN CORSO DI INFEZIONE DA VIRUS C.

La steatosi epatica è una caratteristica istologica propria dei pazienti infettati dal virus C dell’epatite (HCV). La steatosi è infatti presente nel 72% dei pazienti HCV, percentuale nettamente superiore a quella riscontrata in corso di infezione da virus B dell’epatite(HBV) o epatite autoimmune. Diversi lavori suggeriscono un ruolo diretto del virus C dell’epatite nell’indurre steatosi, fatto che provoca una progressione più importate della fibrosi e una minore risposta alla terapia antivirale. Di particolare interesse è il ruolo svolto dallo stress ossidativo indotto dal virus nell’alterazione del metabolismo lipidico in corso di infezione. Studi da noi condotti su pazienti steatosici NAFLD (NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE) ed HCV hanno messo in luce l’elevato livello di ossisteroli plasmatici, 7 beta-idrossi-colesterolo e 7 cheto-colesterolo, prodotti di per ossidazione del colesterolo, soprattutto nei pazienti infetti. Tali molecole dall’ampio impatto biologico sono i ligandi naturali di recettori nucleari chiamati Liver X Receptor (LXR) responsabili della modulazione del metabolismo lipidico, glucidico e del trasporto del colesterolo. Non solo, gli elevati livelli di queste molecole sembrano correlare inversamente con i livelli di LDL circolanti nei pazienti HCV, a differenza di quanto riscontrato nei pazienti NAFLD. Tali risultati non solo dimostrano l’impatto dell’infezione sul metabolismo lipidico, ma mettono anche in luce le significative differenze metaboliche che sottendono all’insorgenza di steatosi epatica virus-relata e non.

Inoltre, mediante la Real Time PCR (RT-PCR) si sta analizzando i profili di espressione adipogenica attraverso lo Human Adipogenesis RT ProfilerTM PCR Array in cellule di epatocarcinoma infettate con HCV. Le indagini condotte rivelano una profonda alterazione metabolica indotta dal virus e la stretta connessione di questa con pathways coinvolte nella proliferazione cellulare e la trasformazione epatica.

Pubblicazioni inerenti:

  1. Comparcola D, Nobili V, Alisi A, Balsano C. Effect of treatment with polyunsaturated fatty acids on HCV- or diet-induced fatty liver.J Hepatol. 2011 Jun;54(6):1325-6.
  2. Arciello M, Petta S, Leoni V, Iannucci G, Labbadia G, Cammà C, Craxì A, Balsano C. Inverse correlation between plasma oxysterol and LDL-cholesterol levels in hepatitis C virus-infected patients. Dig Liver Dis. 2012 Mar;44(3):245-50.

 

STUDIO DEL RUOLO DEL METABOLISMO DEL COLESTEROLO NELLA MODULAZIONE DEL LA RISPOSTA IMMUNITARIA IN CORSO DI INFEZIONE CRONICA DA VIRUS C DELL’EPATITE

L’infezione cronica da HCV è accompagnata da manifestazioni sia epatiche che extraepatiche, ed in particolar modo da patologie del sistema immunitario, nella forma di disordini autoimmuni e/o linfoproliferativi. Studi recenti suggeriscono come l’evoluzione delle infezioni virali dell’epatite C, l’infiammazione cronica e disordini autoimmuni siano profondamente influenzati da cellule T helper CD4+ esprimenti IL-17, indicate in letteratura come T helper 17 (TH17). E’ stato descritto come l’attività di LXR, recettore nucleare regolatore del metabolismo del colesterolo, sia in grado di influenzare la differenziazione di cellule Th17.

È noto che l’HCV è in grado di modulare l’attivazione di LXR alfa/beta sia direttamente, interagendo con il suo partner eterodimerico (RXR), che indirettamente, attraverso l’aumento dei livelli di ossisteroli.

Sulla base dei dati sopra riportati è stato condotto uno studio su pazienti con infezione cronica da HCV sottoposti ad una dieta di 30 giorni normocalorica con basso contenuto di colesterolo, utilizzando pazienti steatotici come gruppo di controllo. Le nostre indaginirivelano che la dieta nei pazienti con infezione cronica da HCV ha prodotto una sostanziale riduzione della frequenza di cellule Th17, correlataad una significativa diminuzione a livello sierico delle citochine da esse prodotte. Parallelamente, abbiamo riscontrato un aumento della percentuale di cellule T regolatorie (Treg, CD4+CD25+FoxP3+). Tale modulazione della risposta immunitaria avviene contemporaneamente ad un aumento dell'attività di LXR, valutata attraverso lo studio dei geni bersaglio: SREBP-1c (sterolregulatoryelement-binding protein-1c) e ABCA-1 (ATP-Binding Cassette Transporter A1). Tali modulazioni non sono state riscontrate nei pazienti NAFLD.

I nostri studi rivelano per la prima volta, come una dieta normocalorica, a basso contenuto di colesterolo, influenzando la modulazione genica responsabile del metabolismo del colesterolo, è in grado di ripristinare l’equilibrio cellulare Th17/Treg, migliorando la risposta immunitaria in pazienti con epatite C cronica ed aprendo una nuova strada per migliorare la suscettibilità alle malattie autoimmuni HCV-correlate.

Pubblicazioni inerenti

  1. MaggioR, ViscomiC, AndreozziP, D’Ettorre G, Viscogliosi G, Barbaro B,Gori M, Vullo V, Balsano CNormocaloriclowcholesteroldietmodulates Th17/Treg balance in patients with chronichepatitis C virus infection. PloSOne 2013.

 

PATOGENESI DELLA STEATOSI EPATICA

L’Epatopatia Steatosica Non Alcolica (NAFLD) è una condizione clinico-patologica, che si riferisce ad uno spettro di quadri clinici che vanno dal semplice accumulo di trigliceridi all’interno degli epatociti (steatosi semplice) fino alla steatosi associata ad infiammazione (steatoepatite non alcolica – NASH), che può progredire fino all’insorgenza dell’epatocarcinoma. La NAFLD, che oggi è considerata la più frequente malattia cronica del fegato nei paesi occidentali, è caratterizzata da un accumulo lipidico a livello epatico in soggetti con modesto o assente consumo di alcol e mancata assunzione/esposizione a determinati farmaci o sostanze. La NAFLD è frequentemente associata alla sindrome metabolica, tanto che ne è considerata la manifestazione epatica. La storia naturale di questa patologia è solitamente benigna ma può evolvere in presenza di ulteriori insulti, ai quali il fegato steatosico è più suscettibile. Il modello patogenetico attualmente accettato per spiegare la progressione della NAFLD è il cosiddetto modello “two-hits” (doppio-colpo). Il primo “colpo” (first hit) determina la deposizione di trigliceridi nel citoplasma degli epatociti, ma affinchè la malattia progredisca è necessario un evento cellulare addizionale (il “second hit”) che promuove infiammazione, morte cellulare e fibrosi, che sono poi le caratteristiche istopatologiche della NASH. Tra i meccanismi alla base dell’accumulo lipidico intraepatico (first hit) c’è sicuramente un’alterazione dell’attività di proteine, note come recettori nucleari, responsabili della regolazione del metabolismo lipidico; tra questi vanno sicuramente menzionati i Liver X Receptors (LXRs) e i PeroxisomeProliferatingAssociatedReceptors (PPARs), responsabili della modulazione della lipogenesi, del trasporto del colesterolo e della beta ossidazione degli acidi grassi. Come è stato dimostrato da numerosi studi condotti su modelli animali, un regime alimentare ricco di grassi (dieta HFD) è in grado di alterarne l’attività trascrizionale. Tra i fattori potenzialmente coinvolti sia nell’insorgenza (“first hit”) che nella progressione (“second hit”) della NAFLD vanno invece menzionati i danni ai mitocondri e lo stress ossidativo (SO). Spesso lo SO è, infatti, correlato a disfunzioni mitocondriali in quanto questi organelli sono sia fonte di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che loro principale bersaglio. Disfunzioni mitoncondriali possono risultare in un’alterazione della beta ossidazione degli acidi grassi, che a sua volta può produrre, non solo un accumulo dei suddetti (“first hit”), ma anche alterazioni del metabolismo energetico e conseguente iperproduzione di ROS. L’over-produzione di ROS associata all’accumulo lipidico promuove l’insorgenza dello SO (“second hit”) anche attraverso vari meccanismi tra cui la perossidazione lipidica, evento estremamente deletereo per le funzioni fisiologiche cellulari. Aumento dei ROS e dei prodotti di perossidazione lipidica, infatti, sono stati riscontrati sia in animali modello di steatosi epatica che in pazienti NAFLD e NASH. Non essendoci attualmente un trattamento accettato per contrastare l’insorgenza e la progressione della NAFLD, numerosi studi sono volti ad individuare molecole con potenziale terapeutico. A tale riguardo, molecole di origine naturale sono soggetto di numerosi studi e di grande interesse, come ad esempio i polifenoli presenti in numerose piante, in grado potenzialmente di contrastare vari meccanismi patologici coinvolti nella NAFLD.

Partendo da questi presupposti abbiamo messo a punto un modello in vitro per lo studio degli effetti dell’accumulo lipidico in cellule di origine epatica focalizzando i nostri studi prevalentemente su geni coinvolti nel metabolismo cellulare, con particolare riguardo a quello lipidico ed energetico, e a quelle pathways note per il loro potenziale coinvolgimento in patologie epatiche (per es. la fibrosi o epatocarcinoma), quali Hedgehog (Hh) e p53, che però recentemente sono state associate alla regolazione metabolica. Parallelamente stiamo svolgendo i nostri studi anche su un modello murino di NAFLD, topi C57BL/6 sottopposti ad un regime alimentare ricco di grassi, nel quale le nostre ricerche hanno sicuramente un profilo più ampio dal momento che nel modello animale è possibile analizzare gli effetti sul metabolismo anche in altri distretti corporei (per es. tessuto adiposo e cuore). Infine, ci prefiggiamo di condurre studi sulle potenzialità terapeutiche di composti polifenolici di origine naturale che potrebbero risultare di estremo interesse per la salute mondiale perché comunemente diffusi e molto spesso assumibili attraverso l’alimentazione.

Pubblicazioni inerenti

  1. Peluso MME, Munnia A, Tarocchi M, Arciello M, Balsano C, Giese RW, Galli A. Exocycilic DNA adducts in a Murine Model of Non-AlcoholicSteatohepatitis. J Carcinog Mutagen. ISSN: 2157-2518. 2013.
  2. Gori M, Barbaro B, Arciello M, Maggio R, Viscomi C, Longo A, Balsano C. Protective effect of the Y220C mutant p53 against steatosis: good news? Journal Cell Physiol 2013.
  3. Gori M, Barbaro B, Arciello M, Balsano C. Paradoxical prosteatotic effect of hedgehog signaling pathway inhibition under conditions of steatosis. Hepatology. 2012 Oct;56(4):1587-8.

 

RUOLO DELLE ALTERAZIONI DELLA MICROFLORA INTESTINALE NELLA PATOGENESI DELLA STEATOSI EPATICA

Nonostante il danno epatico possa essere provocato da diverse cause (virale, tossica, metabolica, ecc), i meccanismi patogenetici che risultano responsabili dei vari tipi di danno (infiammazione, steatosi, fibrosi, cirrosi) sono molto simili. L’induzione e la progressione del danno epatico cronico generalmente hanno origine con la necrosi degli epatociti, seguita dal reclutamento delle cellule macrofagiche, dalle cellule del sistema immunitario ed infiammatorio (neutrofili, linfociti e cellule di Kupffer); queste possono risultare selettivamente attivate in relazione al tipo di causa scatenante il danno epatico.

Il fegato può reagire al danno procuratogli principalmente attraverso tre meccanismi di riparo: l’apoptosi, la rigenerazione degli epatociti e la fibrosi (attraverso l’attivazione delle cellule stellate).

Oltre al danno diretto prodotto da vari agenti causali, sembra che le alterazioni della microflora intestinale giochino un ruolo importante nell’induzione della steatosi e nella progressione del danno epatico così come avviene nelle IBD (malattie infiammatorie dell’intestino).

Solitamente per alterazioni della microflora intestinale si intendono la crescita eccessiva ed il rilascio nel circolo sanguigno delle endotossine batteriche (LPS, peptidoglicani, lipoproteine ed vari lipopeptidi ecc.) notoriamente definite PAMPs (Pathogen-associatedmolecularpatterns). L’endotossiemia è stata riscontrata in diverse patologie epatiche e sembra responsabile dell’induzione di una cascata patogenetica che si traduce in un ulteriore insulto epatico. È noto, infatti, che prodotti batterici attraverso il circolo sanguigno raggiungono gli altri distretti corporei, incluso il fegato, dove interagiscono con recettori di riconoscimento specifici chiamati TLR (Toll Like Receptor) i quali portano all’induzione del pathway di NF-kB.

Nell’uomo la famiglia dei recettori TLR è composta da 10 membri; i TLR sono coinvolti nella risposta immune innata dove agiscono da sensori di agenti patogeni, ma risultano implicati anche in numerosi altri processi tra cui la risposta immunitaria adattativa, la regolazione della risposta infiammatoria, la promozione della rigenerazione epiteliale nonché la carcinogenesi. Ai TLR viene attribuito un ruolo sempre più importante nella patofisiologia delle malattie del fegato e rappresentano il collegamento tra le alterazioni della flora batterica intestinale, l’endottossiemia e le patologie epatiche. Un ulteriore link tra la steatosi epatica e le IBD può esser costituito dallo stress ossidativo (SO); è ben noto, infatti, il legame tra l’SO e la steatosi epatica, tuttavia sembra che questo possa essere rilevante anche in corso di infiammazione dell’intestino. Tra i vari fattori immunomodulanti attivati e/o prodotti in corso di IBD, infatti, le specie reattive dell’ossigeno (ROS) risultano prodotte a livelli eccezionalmente alti. I loro effetti devastanti possono contribuire sia all’insorgenza che alla progressione della malattia sarebbe quindi di estremo interesse comprendere le relazioni che intercorrono tra la steatosi epatica e lo stress ossidativo in corso di IBD anche nei bambini. I nostri studi sono quindi volti ad investigare la fitta rete generata dalle IBD, le alterazioni della microflora intestinale, lo stress ossidativo e la steatosi epatica.

Pubblicazioni inerenti:

  1. Abenavoli L, Scarpellini E, Rouabhia S, Balsano C, Luzza F. Probiotics in non-alcoholicfattyliverdisease: which and when. Ann Hepatol. 2013 May-Jun;12(3):357-63.
  2. Alisi A, Panera N, Balsano C, Nobili V. Activation of the endotoxin/toll-like receptor 4 pathway: the way to go from nonalcoholic steatohepatitis up to hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2011 Mar;53(3):1069.

 

RUOLO DELL’INQUINAMENTO AMBIENTALE SULLE PATOLOGIE EPATICHE

Il fegato è un organo di vitale importanza per l’uomo, infatti il suo stato è spesso riflette la salute dell’individuo. Numerose patologie affliggono quest’organo, la più diffusa delle quali ad oggi è la NAFLD, probabilmente a causa delle modificazioni dello stile di vita occorse negli ultimi anni. La NAFLD è una patologia multifattoriale e con un quadro istologico estremamente variegato. Nell’ultima decade, una notevole quantità di evidenze sperimentali mettono in luce il potenziale patologico di una vasta gamma di inquinanti ambientali, anche per il fegato. Purtroppo, il progresso tecnologico e l’industrializzazione hanno come conseguenza il rilascio nell’ambiente di numerose sostanze quali pesticidi, solventi, metalli pesanti, prodotti di scarico e particolato. Per molti di questi è già stato descritto o ipotizzato un grande potenziale steatogenico, per cui anche loro devono esser considerati a tutti gli effetti fattori di rischio tangibile per l’insorgenza della NAFLD e di quelle patologie dismetaboliche la cui diffusione è sempre maggiore e le cui cause appaiono ad oggi ancora poco comprese.

Pubblicazioni inerenti:

  1. Arciello M, Gori M, Maggio R, Barbaro B, Tarocchi M, Galli A, Balsano C. Environmentalpollution: a tangiblerisk for NAFLD pathogenesis. Int J Mol Sci. 2013 Nov 7;14(11):22052-66. doi: 10.3390/ijms141122052.

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